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蛋白質的分離純化方法
更新時間:2012-05-02   點擊次數:3244次

蛋白質的分離純化方法

沉淀法:原理:是使蛋白質膠體顆粒的表面水化膜或表面電荷破壞,從而使蛋白質沉淀。

• 鹽析法

• 有機溶劑沉淀法

• 等點電沉淀法

• 選擇性變性沉淀法

• 聚合物沉淀法

在生物大分子制備中zui常用的幾種沉淀方法是:

• 中性鹽沉淀(鹽析法):zui大的特點是環境溫和,不易造成蛋白質變性。因此適用于各種蛋白質和酶的分離純化。缺點是分辨率底,且后續處理時需要除鹽。  

• 有機溶劑沉淀:分辨率高于鹽析法,但容易引起目的蛋白失活。所以多用于生物小分子的分離純化比如多肽、寡肽。

• 等電點沉淀:其局限是,須事先了解蛋白的PI;且沉淀過程中可能發生變性和失活,部分蛋白等電點沉淀后不容易溶解,因此較少用于目的蛋白的沉淀。用于氨基酸、蛋白質及其他兩性物質的沉淀,但此法單獨應用較少,多與其他方法結合使用。

• 選擇性沉淀(熱變性沉淀和酸堿變性沉淀):多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。三氯yi是比較常用的酸變性劑,尤其在分析樣品的濃縮而不需考慮活性的條件下用得多。

• 有機聚合物沉淀:是發展較快的一種新方法, 主要使用PEG聚乙二醇作為沉淀劑,常用PEG600020000。它條件溫和,不易變性,且沉淀效果強,很少量的PEG可沉淀大量的蛋白。缺點是PEG除去比較困難。

根據分子大小不同:超濾法、透析法(膜分離法)、超速離心法、 凝膠過濾法(GF)也稱大小排阻層析,是一種根據分子的大小和形狀來進行分離的方法。不同的蛋白質分子通過凝膠微孔時因遷移能力不同而被分離。利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相,(在其分離范圍內)按分子大小將樣品中各組份分離開來。大分子先被洗脫,小分子后被洗脫。應用:脫鹽 Sephadex G10、25,中間純化 Sephadex G200,精純 Sephacryl 、Superdex。常用填料:Sephadex系:是以氯代環氧丙烷進行交聯的葡聚糖珠狀凝膠,經典的凝膠介質。Sepharose:經過純化的瓊脂糖,含極少的帶電集團。型號zui多、應用zui廣。Sephacryl系:有是丙基葡聚糖與N,N’-亞甲基雙丙稀酰胺共聚而成,經濟。Superdex系:是葡聚糖與瓊脂糖共聚而成的復合凝膠,,選擇性強,分辨率*。

• 凝膠類型:葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)。

• 葡聚糖凝膠:直鏈的葡聚糖分子和交聯劑31,2環氧丙烷交聯而成。 

凝膠回收處理方法:將樣品*洗脫下來后,繼續用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后,將柱下口放在小燒杯中,慢慢打開,再將上口慢慢松開,使凝膠全部回收至小燒杯中,備用。

G類葡聚糖凝膠常用G-X代表,X數字既代表交聯度,也代表特水量。X數字越小,交聯度越大,網孔越小,適用于分離低分子質量生化產品。X數字越大,交聯度越小,網孔越大,適用于分離高分子生化產品。X數字也代表凝膠的持水量,如G-25表示1g干膠持水2.5mLG-100表示 1g干膠持水10mL,依次類推。葡聚糖凝膠和生物膠多以干粉形式保存,使用前需用水或洗脫緩沖液充分溶賬。在室溫下讓其充分溶賬脹達到平衡,通常需要較長時間。較快的做法是將干膠往水里加,邊加邊攪,以防凝膠結塊,然后放到沸水浴中加熱接近100℃,幾個小時就可以使其溶脹,還可起到除去顆粒內部氣泡和殺菌作用。新柱裝好后,要用洗脫緩沖液平衡,一般用35倍體積的緩沖液在恒壓下流過柱床。新裝好的柱要檢驗其均勻性-可用帶色的高分子物質如藍色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過柱,觀察色帶是否均勻下降。也可以對光檢查,看其是否均勻或有無氣泡存在。 

蛋白質的分離純化方法

凝膠用過后,有幾種保存方法:

濕態保存:在水相中加防腐劑,或水洗到中性,高壓滅菌封存(或低溫存放);

濕態保存:在水相中加防腐劑,或水洗到中性,高壓滅菌封存(或低溫存放);

干燥保存:水洗后濾干,依次用50%、70%、90%、95%乙醇脫水,再用乙醚洗去乙醇,干燥6080℃烘干)后保存。加乙醇時,切忌一上來就用濃乙醇處理,以防結塊

對生物樣品來說,經常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質分開,如蛋白質與鹽類,稱作類分離或組分離。例如從蛋白質溶液中除去無機鹽。我們知道,蛋白質的分子量都大于5000D,而無機鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用Sephadex G-25凝膠作為分離固定相,因為它的分離范圍是10005000D。被分離的兩組物質的分子量正好落在分離范圍的兩側。大分子組為全排阻,而小分子組為全滲入,其Kd值的差可達zui大值1。對于分子量小于5000D的肽類進行脫鹽操作則常選用Sephadex G-15凝膠。

另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質加以分離,如分離血清球蛋白與白蛋白,這叫做分級分離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。下面以zui常用的葡聚糖凝膠類為例,分別加以討論 。

葡聚糖凝膠離子交換劑使用方法

新購進的陽離子交換劑(如CM-Sephadex C-25)為Na型,陰離子凝膠交換劑(如DEAE-Sephadex A-25)為Cl-型,使用前要按一般離子交換劑的使用方法進行轉型處理。1g陰離子交換劑約用100mL,0.5mo1/L NaoH溶液浸泡20min后減壓過濾,充分洗滌,再用等量0.5molL HCL處理,洗至中和備用。陽離子交換劑lg約用100mL 0.5molL HCL浸泡20min后過濾,充分洗滌,再用等量0.5mo1L NaOH溶液處理20min,洗至中性備用。將以上處理好的葡聚糖凝膠離子交換劑,用2030倍量與層析時所用的同種緩沖液浸泡(但濃度要高,如0.10.5molL),再用同種酸或堿調節至所需要pH值,放置1h后,待pH值不變即可減壓過濾。

型號

分離范圍Da

粒徑

建議流速cm/h

Sepharose 2B

70-40,000

60-200

10

Sepharose 4B

60-20,000

45-165

11.5

Sepharose 6B

10-40,000

45-165

14

Sepharose CL-2B

70-40,000

25-75

15

Sepharose CL-4B

60-20,000

25-75

26

Sepharose CL-6B

10-40,000

25-75

30

Sepharose 6

5-5,000

20-40

30

Sepharose 12

1-300

20-40

30

Sepharose FF 6

10-4,000

平均90

300

Sepharose FF 4

60-20,000

平均90

250

• 根據分子所帶電荷差異電泳法、等電聚焦等。離子交換層析法(IEX):原理:首先是根據蛋白質的帶電類型(陽離子或陰離子),然后根據其相對電荷強度進行分離。PH:陰離子交換層析:蛋白質帶負電荷,則要求PH>PI,但不能高于介質功能基團的PK;陽離子交換層析:蛋白質帶正電荷,則要求PH<PI,但不能低于介質功能基團的PK;緩沖溶液:陰離子交換層析:Tris-HCl   陽離子交換層析:PB。帶電荷量少,親和力小的先被洗脫下來,帶電荷量多,親和力大的后被洗脫下來。陽離子交換劑 — 帶負電荷,與陽離子交換;陰離子交換劑 — 帶正電荷,與陰離子交換。

常見問題分析:

不吸附:緩沖溶液PH不對;離子強度太高;

峰形不穩或出現奇異峰:柱床中有氣泡或緩沖溶液不純

分辨率低:梯度太大;流速太高

前沿峰:柱過載;填充效果差;柱需再生

峰拖尾:樣品在柱濾膜上或凝膠床頂部沉淀

基線隨梯度上移:鹽濃度臨近CMC

1.離子交換樹脂

2.離子交換纖維素

§ 陰離子交換纖維素 —:DEAE-纖維素  pH8.6以下分離中性或酸性物質,具二乙胺乙基

§ 陽離子交換纖維素:CM-纖維素  一般pH>4條件下使用,具有羧甲基 

3.離子交換凝膠—  分離大分子物質

離子交換劑的選擇考慮因素:

1.被分離物質帶何種電荷

2.被分離物質分子的大小

大分子物質選用凝膠,其次選用纖維素

3.被分離物質所處的環境

4.被分離物質的物理化學性質

5.被分離物質的大概數量

根據疏水性不同:疏水層析(HIC)、反相色譜(RPC) 原理:是指固定相的極性低于流動相的極性,在這種層析過程中,極性大的分子比極性小的分子遷移速度快而先被洗脫下來。一般使用甲醇、乙腈作流動相,使得蛋白質容易變性失活;常用于HPLC分析,與在水-有機相中穩定的多肽和低分子量蛋白質的分離。

蛋白質的分離純化方法

梯度淋洗裝置

外梯度:利用兩臺高壓輸液泵,將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室,混合后進入色譜柱。

內梯度:一臺高壓泵通過比例調節閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。

示差折光檢測器:可連續檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數差值。差值與濃度呈正比;可連續檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數差值。差值與濃度呈正比;

親和層析(AC)

色譜技術

 

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