【實驗目的】
1．了解用逆轉錄PCR法獲取目的基因的原理。
2．學習和掌握逆轉錄PCR的技術和方法。
【實驗原理】
聚合酶鏈式反應(PCR)過程利用模板變性，引物退火和引物延伸的多個循環來擴增DNA序列。因為上一輪的擴增產物又作為下一輪擴增的模板，是一個指數增長的過程，使其成為檢測核酸和克隆基因的一種非常靈敏的技術。一般經25-35輪循環就可使模板DNA擴增達106 倍。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA(complement DNA)合成(即RNA的反轉錄(RT，reversetranscription))，同cDNA的PCR結合在一起的技術，提供了一種基因表達檢測、定量和cDNA克隆的快速靈敏的方法。由于cDNA包括了編碼蛋白的完整序列而且不含內含子，只要略經改造便可直接用于基因工程表達和功能研究，因此RT-PCR成為目前獲得目的基因的一種重要手段。
RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平、表達差異，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。
RT-PCR的基本原理。首先是在逆轉錄酶的作用下從RNA合成 cDNA，即總RNA中的mRNA在體外被反向轉錄合成DNA拷貝，因拷貝DNA的核苷酸序列*互補于模板mRNA，稱之為互補DNA(cDNA)；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA*鏈為模板，以四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)為材料，在引物的引導下復制出大量的cDNA或目的片段。
RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個樣品檢測或克隆多個基因的mRNA時比較有用。在兩步法RT-PCR中，每一步都在*條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產物進行PCR。而一步法RT-PCR具有其它優點(表4.2)，cDNA合成和擴增反應在同一管中進行，不需要打開管蓋和轉移，有助于減少污染。還可以得到更高的靈敏度，zui低可以達到0.1pg總RNA，因為整個cDNA樣品都被擴增。對于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特異性引物(GSP)起始cDNA的合成。
隨機引物法是三種方法中特異性zui低的。引物在整個轉錄本的多個位點退火，產生短的，部分長度的cDNA。這種方法經常用于獲取5"末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得zui長的cDNA，需要按經驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應體系。因為使用隨機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高。它同大多數真核細胞mRNA 3"端所發現的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機引物相比，cDNA的數量和復雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優化。建議每20μl反應體系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數RT-PCR。
基因特異性引物(GSP)對于逆轉錄步驟是特異性的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設計PCR引物的規則同樣適用于逆轉錄反應GSP的設計。GSP可以同與mRNA 3"zui末端退火的擴增引物序列相同，或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。
已經制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣，可以插入到質粒或噬菌體中，為此，首先必需有適當的接頭(Linker)，接頭可以是在PCR引物上增加限制性內切酶識別位點片段，經PCR擴增后再克隆入相應的載體；也可以利用末端轉移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質粒,并轉化到宿主菌中進行擴增。
本實驗是要從小鼠肝臟組織中獲取Fas配體基因，Fas配體(FasL)是一分子量約為40u的II型跨膜糖蛋白，屬TNF家族成員?；罨腡細胞可表達Fas和FasL，并通過Fas/FasL系統介導細胞凋亡作用，保持機體免疫系統的自穩態。近年研究發現在部分癌細胞中FasL表達增強，并與腫瘤的復發轉移有關。我們采用RT-PCR方法克隆FasL全長cDNA并構建其表達載體，可以為進一步研究FasL的功能提供條件。在上下游引物的5’端分別加上了限制酶切位點及其保護堿基(即Hind III和BamH I)，以便可以通過雙酶切將目的片段定向的克隆到原核表達載體pGFPUv上(附錄圖4.3)。
為了便于后續實驗可以用金屬螯和層析的方法分離和純化目的蛋白，我們改造了pGFPUv，在其上加了6×His標簽。
【試劑與器材】
(一)試劑
1.總RNA(或mRNA)
2.RNA酶抑制蛋白(RNase Inhibitor) ：40 U/mL
3.dNTP 混合物 (各10 mM)
4.oligo(dT)12-18：2.5 ?mol/L
5.10*逆轉錄合成緩沖液(10?RT buffer)：250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2
6.AMV逆轉錄酶 5u/?L
7.基因特異性5’和3’引物各20 ?mol/L
8.Tap DNA聚合酶 5u/?L
9.10*PCR緩沖液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris•Cl，在25℃下，pH9.0，1.0% Triton X-100，15mmol/L MgCl2。
(二)器材
1)PCR儀，
2)PCR管，
3)微量移液器
【操作方法】
(一)逆轉錄：
1)建立RT反應體系：
2)渦旋混勻，42℃反應1小時，95℃加熱5分鐘，然后置于冰上。
(二)PCR擴增：
1)建立PCR反應體系：
2)將上述反應體系渦旋混勻, 按下列程序運行循環：
step2-4運行30個循環，其中復性溫度主要依據引物的不同而不同。
(三)取10-20uL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，余下的PCR產物-20℃保存。
【注意事項與提示】
1.逆轉錄反應過程，需建立無RNAase環境，以避免RNA的降解。
2.成功的逆轉錄反應決定于高質量的模板RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。此外，RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol Reagent，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。因此在進行PCR反應時應該對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照反應，以確定擴增出來的片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產物來源于基因組。
3.RT-PCR的起始模板可是總RNA或mRNA，都可以檢測到擴增結果(如下圖)。另外，分離mRNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產生偏差。然而，當分析稀有基因時，使用mRNA會增加檢測的靈敏度。
4.在逆轉錄反應中經常加入RNA酶抑制蛋白以增加cDNA合成的長度和產量。RNA酶抑制蛋白要在*鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。RNA酶抑制蛋白僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心試驗者的手上Rnase對樣品的污染。
5.較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。對于多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性后也是如此。對這些困難模板的擴增可以使用經過改良的耐高溫逆轉錄酶， 如：Invitrogen 公司的ThermoScript逆轉錄酶，使逆轉錄反應置于較高溫度下進行以改善擴增。而且適當提高逆轉錄保溫溫度，可增加RT-PCR的特異性。
6.建立反應體系時，加完其它反應物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后將全部反應物渦旋混勻；上PCR儀前加礦物油封蓋或設熱蓋。
7.PCR反應的循環數一般25-30次就足夠了，過多的循環數會造成非特異性擴增和時間的浪費。復性溫度的計算，一般是在引物的Tm值上下浮動，Tm =2(A+T)+4(G+C)。適當提高復性溫度可提高PCR擴增的特異性。
8.不管是反轉錄反應還是PCR反應都應先調制試劑的Master Mix (包括RNase Free dH2O、緩沖液、dNTP Mixture等)，然后分裝到每個反應管中。這樣可使所取的試劑的體積更準確，減少試劑的損失，避免重復分取同一試劑，同時也可以減少實驗操作造成的誤差。而且分裝試劑時務*新Tip，以防止樣品間的污染。
9.AMV、RNase Inhibitor、Taq等酶類，要輕輕地混勻，避免起泡。分取之前要輕輕地離心收集到反應管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶類務必在實驗前從-20℃取出，使用后立即放回-20℃保存。
10.*的PCR條件，因PCR擴增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前先做Control反應，以確定*的PCR條件。為延長PCR儀的使用壽命，應盡可能縮短PCR儀4℃保存的時間，盡量避免4℃過夜的情況。
Lane 1：總RNA 的 RT-PCR 產物(人細胞調亡因子TF15基因)
Lane 2： mRNA 的 RT-PCR 產物，人細胞調亡因子TF15基因
Lane 3： 100bp marker
【實驗安排】
1．*天：試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase處理(0.1%DEPC浸泡或高溫干烤)。
2．第二天：進行(一)逆轉錄和(二)PCR擴增。
3．第三天：進行(三)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4．為了保證實驗質量，能將總RNA提取、mRNA的分離純化、RT-PCR和cDNA文庫構建實驗安排在連續的時間內進行。
【實驗報告要求與思考題】
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